激光共聚焦顯微鏡的基本觀察步驟

　　激光共聚焦顯微鏡是一種高分辨率的顯微成像技術(shù)。普通的熒光光學(xué)顯微鏡在對(duì)較厚的標(biāo)本(例如細(xì)胞)進(jìn)行觀察時(shí)，來自觀察點(diǎn)鄰近區(qū)域的熒光會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)的分辨率形成較大的干擾。共聚焦顯微技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于，每次只對(duì)空間上的一個(gè)點(diǎn)(焦點(diǎn))進(jìn)行成像，再通過計(jì)算機(jī)控制的一點(diǎn)一點(diǎn)的掃描形成標(biāo)本的二維或者三維圖象。在此過程中，來自焦點(diǎn)以外的光信號(hào)不會(huì)對(duì)圖像形成干擾，從而大大提高了顯微圖象的清晰度和細(xì)節(jié)分辨能力。
 

　　樣品制備是檢測前的關(guān)鍵步驟，樣品需要用熒光探針(單，雙和三)標(biāo)記。標(biāo)本可以是固定的或活組織，或固定或活的貼壁培養(yǎng)。細(xì)胞應(yīng)在共聚焦特殊培養(yǎng)皿或蓋玻片，懸浮細(xì)胞，萼片或滴劑和蓋玻片上培養(yǎng)，覆蓋。樣品厚度約1~2mm，蓋玻片厚度應(yīng)小于0.17mm，滑塊厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間，表面光滑，厚度均勻，并且沒有明顯的干擾熒光。固定樣品通常用密封片密封，通常使用通過使用pH 8.5-9的PBS制備的甘油密封。
 

　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制備樣品完畢后。即可進(jìn)行觀察，基本步驟如下：
 

　　(1)開啟儀器電源及光源：一般先開啟激光共聚焦顯微鏡和激光器，再啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，然后啟動(dòng)操作軟件，設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長，選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊。以便光電倍增管檢測器能得到足夠的信號(hào)結(jié)果。
 

　　(2)設(shè)置相應(yīng)的掃描方式：在目視模式下.調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù)，在顯微鏡下找到需要檢測的細(xì)胞。切換到掃描模式，調(diào)整雙孔針和激光強(qiáng)度參數(shù)，即可得到清晰的共聚焦圖像。
 

　　(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結(jié)果即可。
 

　　(4)關(guān)閉儀器：儀器測定樣品結(jié)束后，先關(guān)閉激光器部分，計(jì)算機(jī)仍可繼續(xù)進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個(gè)激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，則應(yīng)該在激光器關(guān)閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計(jì)算機(jī)及總開關(guān)。